Аллелоспецифическая полимеразная цепная реакция аллель-с ПцР

Аллелоспецифическая полимеразная цепная реакция, аллель-с. ПцР * алеласпецыфічная полімеразная ланцуговая рэакцыя, алель-с. ПЛР * allele-specific polymerase chain reaction or AS-PCR — амплификация определенных аллелей, или вариантов последовательностей ДНК, в том же локусе. Специфичность достигается синтезом одного или двух ПЦР (см.) праймеров таким образом, чтобы они перекрывали сайт с другой последовательностью, расположенный между аллелями. Для эффективного осуществления ПЦР 31-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях ошибочно спаренных нуклеотидов может отсутствовать вообще. Именно эта особенность ПЦР и лежит в основе метода выявления мутаций с помощью А. ПЦР, иначе иногда называемой аллель-специфической элонгацией праймера (allele specific primer elongation or a. s. p. extension). Схема высокоэффективной А. ПЦР была разработана и использована для диагностики мутации Leiden при тромбофилиях. Эта мутация локализована в экзоне 10 фактора V системы свертывания крови человека и часто ассоциирована с синдромом ее повышенной свертываемости. В соответствии с последовательностью нуклеотидов анализируемого участка генома синтезируют два праймера, 31-концевой нуклеотид одного из которых комплементарен мутантному нуклеотиду матричной ДНК, а у другого — нуклеотиду дикого типа. Для усиления специфичности действия праймеров вблизи их 31-концов вводят некомплементарные матрице нуклеотиды. Для исключения ложноотрицательных результатов в пробах, где продукт ПЦР отсутствует, повышали число циклов ПЦР сверх оптимального. Другой тип универсальных аллель-специфических праймеров содержит 31-концевой нуклеотид, всегда некомплементарный матрице, а мутатный нуклеотид матрицы попадает во внутреннюю часть праймера. В этом случае продукты ПЦР отсутствуют, если в гибриде во внутреннюю часть праймера попадает любой некомплементарный мутантный нуклеотид матричной ДНК вне зависимости от его точной локализации. Такие праймеры позволяют обнаруживать любые точковые мутации в гомозиготном состоянии и у гаплоидных микроорганизмов. Для выявления гетерозиготного состояния анализируемого гена иногда используют мутантный и нормальный праймеры разных размеров, которые различаются по длине их 51 концевых последовательностей, полностью комплементарных анализируемой ДНК. В этом случае в процессе ПЦР в реакционную смесь можно одновременно добавлять оба аллель-специфических праймера: му тантный и нормальный. Образовавшиеся продукты реакции, соответствующие мутантному аллелю и аллелю дикого типа, далее разделяют электрофоретически в гелях, используемых для секвенирования нуклеиновых кислот.